引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。

設計引物應遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基：G+C 含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC*隨機分布，避免5 個以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。

④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的堿基，特別是*末及倒數第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列*有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以*低引物 量產生需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。